植物开花转变是植物个体发育和后代繁衍的中心环节，受内源信号和外部生长环境的综合调控。在双子叶模式植物拟南芥中，该转变主要是由光周期途径、春化途径、自主开花途径和赤霉素途径进行调控(郑永胜等, 2012; 夏志强等, 2007)。虽然较双子叶植物而言，单子叶植物在开花转变过程中涉及到的基因及其调控模式虽有所不同，但是已有研究证明，光周期途径、春化途径、自主开花途径在单子叶植物中也有存在，例如小麦，水稻和二穗短柄草等(Dong et al., 2012; Higgins et al., 2010; Winichayakul et al., 2005)。

FLD (FLOWERING LOUCUS D)是自主途径中的一个功能基因，在植物中编码一个与人的组蛋白赖氨酸去甲基化酶1 (Lysine-Specific Demethylase 1, LSD1)同源的蛋白，参与FLC (FLOWERING LOCUS C)组蛋白的去甲基化和去乙酰化修饰(Bäurle and Dean, 2008; He et al., 2003; Jiang et al., 2007; Liu et al., 2007)，通过沉默花发育抑制因子FLC，促进其下游基因如SOC1和FT的表达，从而启动花原基的发育(Helliwell et al., 2006; Hepworth et al., 2002; Michaels and Amasino, 2001)。尽管双子叶植物如拟南芥的自主开花途径已基本清楚，但单子叶植物相应途径的调控作用及涉及到的各基因的序列和功能都是未知的。

凤梨科(Bromeliaceae)植物为单子叶多年生草本植物。凤梨自然开花一般发生在短日和低夜温的环境，然而，只要达到其生理成熟阶段，周年都可开花(刘海涛, 2004, 观赏凤梨, 广东科技出版社, 75-77)。由于凤梨花期的不确定性给生产种植者们带来了很大的经济损失，利用乙烯或其衍生物促进开花成为凤梨商业化种植中最关键的技术之一(信彩云和李志英, 2009)。有报道表明乙烯及其信号途径中的某些基因可能通过影响植物花发育途径中相关基因的表达而参与了开花调控(Achard et al., 2007; Wuriyanghan et al., 2009)，在乙烯诱导凤梨开花过程中，自主途径中相关基因是否做出响应并参与调控和如何调控的机理目前尚不清楚。

因此，研究凤梨自主开花途径相关基因对进一步揭示凤梨科植物花发育调控机理及丰富单子叶植物开花调控理论具有重要意义。本研究对自主途径的重要基因FLD进行了克隆和序列分析，同时分析了蜻蜓凤梨茎尖的FLD基因在乙烯处理不同时间后的表达量的变化，为进一步研究FLD基因及自主途径中其它相关基因的调控机理奠定基础。

1结果与分析
1.1蜻蜓凤梨FLD基因的全长的克隆
通过RACE-5'和RACE-3'扩增分别得到目的片段，经过纯化回收并测序，RACE-5'长度为843 bp，RACE-3'长度为996 bp (图1)。将测序结果与原有EST序列拼接，获得FLD基因的完整序列。根据所拼接的全长设计全长引物进行PCR扩增，电泳检测，在预期范围获得了特异条带(图1)。经测序后与拼接的序列进行比对，结果完全一致，故最终确定了FLD的cDNA全长序列。

图1 FLD 克隆电泳图 Figure 1 The results of FLD RACE and full length PCR amplification

1.2蜻蜓凤梨FLD基因的生物信息学分析
1.2.1阅读框和序列理化性质分析
蜻蜓凤梨FLD基因序列长度为2 878 bp，开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为2 181 bp，编码727个氨基酸。用Protparam预测其分子量为78.734 kD，等电点(PI)为6.40，带正电荷的氨基酸68个(Arg+Lys)，带负电荷的氨基酸73个(Asp+Glu)，蛋白不稳定系数为44.54，是不稳定蛋白。通过SignaIP4.0进行预测，未发现有信号肽，故预测FLD蛋白为非分泌蛋白。TMHMM跨膜区预测分析表明该蛋白无跨膜区，非膜蛋白。利用predictprotein预测FLD蛋白的二级结构：α-螺旋(Alpha helix)占21.3%，延伸链(Extended strand)占12.4%，环状结构(loops)占66.3%。

1.2.2保守区域分析
通过Conserved Domains分析FLD蛋白。在N端，含有一个SWIRM保守结构域参与蛋白质互作(图2)，该结构域存在于染色体蛋白中，并由85个氨基酸残基组成一个α-螺旋。在C端，含有一个胺基氧化酶的结构域(Amino Oxidase) (图2)，该结构域同时含有FAD Binding结构域和底物结合结构域，两者共同构成胺氧化反应的中心。

图2 FLD 保守结构域分析 Figure 2 Analysis the conserved domain of FLD

1.2.3同源性比较及基因家族系统进化树分析
DNAMAN分析表明，FLD cDNA推导的氨基酸序列与玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的FLD蛋白有较高一致性，分别为72%和73% (图3)。通过BLAST比对发现FLD、LDL1、LDL2、LDL3蛋白它们含有相同的保守结构域，属于LSD1蛋白亚家族中一员，即FLD与LDL1、LDL2、LDL3是同源基因。

图3 蜻蜓凤梨, 拟南芥, 玉米FLD 氨基酸序列比对 Figure 3 The alignment of amino acid sequence of AfFLD, AtFLD and ZmFLD

为了研究蜻蜓凤梨中FLD基因的进化关系，对Genbank收录的不同植物来源的FLD基因以及其同源基因序列利用Clusta X进行多重比对，再用MEAG5.0中的邻位相连法(Neighbor-joining)构建进化树(图4)。其中包括粉菠萝1个家族成员(AfFLD)，大豆(Glycine max)3个成员(GmLDL1~GmLDL3)，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 1个成员(GmLDL)，葡萄(Vitis vinifera) 3个成员(VvLDL1~VvLDL3)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)三个成员(AtLDL1, AtLDL2, AtFLD)，短柄草(Brachypodium distachyon)3个成员(BdLDL1~BdLDL3)，玉米(Zea mays) 1个成员(ZmFLD)。除此之外还有4个与FLD高同源性(70%以上)的未确定功能基因，分别为：水稻(Oryza sativa Japonica Group Os04g0560300, OsJG)、大麦(Hordeum vulgare hypothetical protein, HvHP)、高粱(Sorghum bicolor hypothetical protein, SbHP)、三角叶杨(Populus trichocarpa hypothetical protein, PtHP)。

图4 蜻蜓凤梨FLD 基因与已知FLD 基因及其基因家族的系统进化树 Figure 4 The phylogenetic tree based on alignment of nucleotide among Aechmea fasciata FLD gene and some published FLD genes and their gene family

1.3乙烯诱导FLD基因表达RealtimePCR检测
分别对蜻蜓凤梨进行乙烯利灌心处理0、1 h、6 h、1 d和2 d，经三次重复实验之后，用荧光定量PCR检测了各处理后l h、6 h、1 d和2 d茎尖分生组织中FLD基因的相对表达量的变化。数据用SAS9.0软件统计单因子方差分析，多重比较用Ducan法进行差异显著性检验，结果用平均值±标准误(x±SE)表示。

结果表明：(1)去离子水对照组AfFLD在0 h~1 d内表达量无显著变化，而在2 d时表达量显著提高，为0 h的1.6倍。(2)乙烯处理1 h组在处理后1 h内有下降的趋势，并且在1 h和6 h表达量持续受到抑制，显著(P＜0.05)降低了AfFLD基因的相对表达量，6 h后表达量逐渐提高，到1 d后表达量恢复到与0 h相同水平。(3)乙烯处理6 h、1 d、2 d三组变化趋势一致，与对照组相比在1 d时显著(P＜0.05)提高了AfFLD基因的表达量，而1 d后表达量都有所下降，其中乙烯处理6 h组在处理后1 d相对表达量为所有处理组中最大，为0 h的2.5倍(图5)。
 

图5 乙烯处理后不同时间FLD基因表达量变化 Figure 5 The relative expression changes of FLD gene treated with ethylene at different time

2讨论
植物自主开花途径是调控花发育的重要内源途径，它通过感受植物体内部的发育状态，并与环境信号相互作用，在一定时期促进开花(He, 2012)。在拟南芥中已经相继克隆到七个与自主途径相关的基因FCA、FY、FLD、FPA、FVE、LD和FLK，它们通过自身的染色质修饰或RNA修饰功能，组成不同的调控亚途径(subpathway)，协同作用于花发育抑制因子FLC来控制花发育的起始，对植物花发育起重要的调控作用(Marquardt et al., 2006; Jiang et al., 2008; Sherrie and Richard, 1996)。Liu等发现自主途径中FCA和FPA在很大程度上是通过FLD而行使调控FLC表达的功能的(Bäurle and Dean, 2008; Liu et al., 2007)，而且LD基因也更多地起着冗余的辅助FLD调控基因表达的作用(Veley and Michaels, 2008)。除了参与调控花发育过程，自主途径中的这些基因可能还行使着不依赖FLC的调控植物其它生长发育的功能。拟南芥自主途径基因双突变体的研究表明，相对野生型而言，双突变株(fpa fld)不仅开花时间明显推迟，植株的生长速率、叶绿素含量和育性也表现显著降低的趋势(Veley and Michaels, 2008)。可见，FLD在植物生长发育尤其花发育调控中起着重要的作用。

乙烯在植物生长发育过程中以及在应对多种环境胁迫的防御反应中起着重要的调控作用，其发挥作用的分子机制在以拟南芥为主的双子叶植物中得到了系统研究，与此相比，人们对单子叶植物中乙烯作用机制，尤其是在参与调控植物花发育方面的相关研究却少有报道。乙烯在不同物种花发育调控过程中行使的功能有很大差异。乙烯在某种程度上能激活赤霉素途径基因DELLAs的活性，DELLA蛋白的积累抑制了花分生组织决定基因LFY和SOC1表达而使拟南芥开花推迟(Achard et al., 2007)。乙烯受体OsETR2可能通过激活光周期途径中OsGI和RCN1的表达延迟水稻花芽分化，乙烯与其受体结合后能使受体活性钝化并启动开花(Wuriyanghan et al., 2009)。

本研究利用蜻蜓凤梨茎尖转录组测序获得的FLD同源基因片段设计引物，通过RACE技术首次从凤梨科植物中克隆了自主开花途径相关基因FLD，并从生物信息学角度对该基因特性方面进行了介绍。蛋白序列分析表明，克隆的AfFLD编码的氨基酸与拟南芥或单子叶植物玉米中相应蛋白均具有较高的同源性，证明了所克隆的FLD基因的准确性。AfFLD蛋白含有LSD1-LIKE亚家族两个高度保守的结构域：SWIRM (Swi3p/Rsc8p/Moira) 结构域和胺氧化酶(amine oxidase like, AOL)结构域。其中，SWIRM结构域是蛋白—蛋白相互作用基序；胺氧化酶结构域又分为FAD结合结构域和底物结合结构域，两者共同构成催化活性中心(Aravind and Iyer, 2002; Shi et al., 2004)。基于LSD1-LIKE核苷酸序列构建的进化树分析表明，LSD1在植物中的同源基因FLD与LDL3聚为一类，LDL1和LDL2各自聚为一类，各类群中单子叶植物和双子叶植物又被分为不同的两类。凤梨与禾本科的水稻、玉米、二穗短柄草、高粱和大麦的同源性较高，但又与禾本科明显分为2类，结果表明其变异与物种的演化关系是一致的。通过对蜻蜓凤梨茎尖分生组织的FLD基因在乙烯处理不同时间的表达模式进行分析，结果表明凤梨AfFLD基因对乙烯处理做出了响应，FLD表达量发生了变化，其中表达量最高为0 h的2.5倍。

通过对蜻蜓凤梨自主开花途径重要基因AfFLD的研究，有助于进一步理解FLD类似基因在植物开花乃至其他生长发育途径中的作用，为阐明凤梨成花的分子机制和乙烯诱导凤梨开花的调控过程提供理论基础。

3材料与方法
3.1材料和主要试剂
实验材料为2年生蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)，取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所实验基地温室。选取无病虫害，株型大小、长势一致植株。

AxyPrep总RNA小量制备试剂盒购于爱思进生物技术(杭州)有限公司；rTaq酶、DL2000 maker、DL15000 marker、pMD18-T Vector、PrimeScripe RTTM Reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ购于宝生物生物工程(大连)有限公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购于Clonetech公司、胶回纯化回收试剂盒购于OMEGA。

3.2材料处理
(1)用ρ=400 mg/L的乙烯利10 mL灌心处理蜻蜓凤梨，分别处理0 h、1 h、6 h、1 d和2 d后倒净，并用去离子水冲洗。对应上述处理设计去离子水灌心处理为对照组，处理组和对照组均设三次重复；(2)取处理后1 h、6 h、1 d和2 d的茎端分生组织，用去离子水洗净后液氮迅速冷冻，放入-80℃超低温冰箱备用。

3.3 RNA的提取及cDNA第一链的合成
用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒提取菠萝茎尖总RNA。cDNA第一链参照PrimeScripe RTTM Reagent Kit说明书合成。

3.4 FLD的克隆与序列分析
根据对蜻蜓凤梨茎尖转录组基因文库中基因片段的筛选，得到1个与FLD同源的cDNA 片段。5'-RACE和3'-RACE扩增参照张鲲等(2011)方法。将上述5'-RACE和3'-RACE结果进行拼接得到FLD基因的理论全长。根据拼接后序列设计其扩增全长的引物M-F和M-R (引物序列见表1)。PCR扩增后送于生物公司测序，得到该基因的cDNA全长。

表1 基因克隆及实时定量PCR 所用引物 Table 1 The primers for gene cloning and real-time PCR used in this research

3.5 FLD生物信息学分析
利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列的查找和同源性比较，利用NCBI的ORF分析基因的最大阅读框，并结合Blastp结果推测全长基因编码的氨基酸序列，采用Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)进行编码蛋白的理化性质的分析；采用SignaIP4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析；使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜区分析；使用predictprotein (https://www.predictprotein.org/login)进行蛋白质二级结构的预测；利用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml) Conserved Domains对FLD保守区域进行分析；利用DNAMAN进行基因同源性比较；利用Clusta X和MEAG5.0进行FLD系统进化树的构建。

3.6乙烯诱导不同时间FLD基因表达分析
利用Primer5.0引物软件设计FLD基因定量分析引物，以β肌动蛋白为内参基因设计引物，引物序列见表1。利用Takara公司的SYBR Premix EX Taq^TM (Perfect Real Time)试剂盒进行Realtime-PCR。反应体系参照说明书为10 μL，扩增条件为：95℃ 1 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。通过软件PikoReal Software2.0进行实验数据的分析，试验设3次重复。

作者贡献
罗轩是本研究的实验设计和实验研究的执行人；丛汉卿参与部分实验设计与执行，罗轩完成试验结果分析并完成论文初稿的写作；李新国和李丽是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室开放基金 (KFKT-2011-06)资助

参考文献
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